测序技术是了解基因组信息，解析遗传密码的重要方法。自20世纪70年代以来，DNA测序已由第一代测序技术发展到第三代测序技术，为揭示人类基因组序列，探究生命的奥秘作出了重要贡献。第三代测序技术，即单分子测序技术，主要包括Helicoscope单分子测序技术、纳米孔测序技术和PacBio单分子实时测序技术，这些技术具有长读长优势，在基因组、转录组、表观遗传组学、单细胞测序和蛋白质测序等领域应用广泛。本文对单分子测序技术的发展历程、工作原理、优缺点及应用领域进行综述，以期为加速人类对DNA、RNA和蛋白质的探索，推动疾病的机制研究和诊疗提供参考。